VedecMgr., PhD. Stanislav Kozmon
Názov projektuŠtúdium reakčného mechanizmu glykozyltransferáz použitím ab initio molekulovej dynamiky ako pomôcky pri návrhu inhibítorov
Hostiteľská organizáciaChemický ústav SAV
Dĺžka projektu01.07.2015 - 31.12.2018

Abstrakt
Glykozyltransferázy (GT), sú nevyhnutnou súčasťou bunkového života u Eukaryotov tým, že produkujú špecifické glykánové väzby, ktoré sú unikátnym príspevkom k rozvoju a funkcie fyziologických systémov v rámci živých organizmov. V poslednej dobe sa tiež poukazuje na významné prepojenie medzi funkciou GT a rôznymi chorobnými procesmi v cicavčích bunkách. Katalytický mechanizmus glykozyltransferáz nie je úplne jasný a preto sa QM výpočty na vysokej úrovni používajú na to aby sme získali sprostredkované nahliadnutie do týchto enzymatických reakcií. Medzi najsofistikovanejšie metódy používané na skúmanie reakčných mechanizmov glykozyltransferáz, a všeobecne enzýmov, patrí použitie hybridných QM / MM výpočtov a QM / MM molekulárne dynamických simulácii. Spomenutými metódami budú študované reakčné mechanizmy N-acetylglukosaminyltransferázy V a O-GlcNAc transferázy. Detailné znalosti reakčného mechanizmu GT sú potrebné pre návrh budúceho inhibítora. Známe prepojenie medzi aktivitou GT a mnohými závažnými ochoreniami, implikuje, že inhibítory týchto enzýmov majú veľký terapeutický potenciál. Nová generácia inhibítorov, ktoré napodobňujú aktivovaný komplex enzymatickej reakcie, môže dosahovať veľmi vysokú efektivitu pri inhibícii.

Zhrnutie projektu s priebežnými výsledkami

Jedna časť projektu bola zameraná na prípravu homológneho modelu glykozyltransferázy GnT-V. Enzým UDP-N-acetylglukózamín: α-D-mannosid β-1-6 N-acetylglukózaminyltransferáza V (GnT-V) katalyzuje prenos N-acetylglukózamínu (GlcNAc) z UDP-GlcNAc (donor GlcNAc) na α-1-6 viazanú manózu centrálnej trimanozylovej štruktúry glykoproteínov za vzniku β-1-6 viazaného vetvenia N-viazaných oligosacharidov. Výskyt β1-6-GlcNAc-rozvetvených N-glykánov je spojený s rastom a metastázovaním rakoviny. Preto inhibícia GnT-V predstavuje kľúčový cieľ pre vývoj liečiv proti rakovine. Avšak, chýbajú akékoľvek informácie o trojrozmernej štruktúre enzýmu a väzbových charakteristikách jeho substrátov. Použitím metód homológneho modelovania sme pripravili prvú 3-D štruktúru GnT-V. Rôzne výpočtové metódy ako porovnávanie primárnej štruktúry, dokovanie donora a akceptora, a molekulovo dynamické simulácie boli použité na vytvorenie siedmych homológnych modelov GnT-V, pomocou ktorých je možné charakterizovať viazanie substrátov do aktívneho miesta GnT-V. Najlepší homológny model je v súlade s dostupnými experimentálnymi dátami. Trojrozmerný model, štruktúra katalytického miesta enzýmu a informácie získané o viazaní donora a akceptora môžu byť užitočné pri štúdiách katalytického mechanizmu a návrhu inhibítorov pre GnT-V.


Obrázok: Homológny model GT-B katalytickej domény (214-623) GnT-V s vyznačenými prvkami sekundárnej štruktúry. 

Reakčný mechanizmus OGT transferázy s modifikovanými substrátmi je ďalším predmetom štúdia v rámci tohto projektu. OGT je UDP-N-acetylglukózmín: polypeptid β-N- acetylglukózaminyltransferáza, ktorá pridáva O-viazaný GlcNAc-ový zvyšok na serín alebo treonín proteínu. Pripravili sme QM/MM modely ternárneho komplexu OGT s UDP-GlcNAc, UDP-5S-GlcNAc ako donormi cukru a serínom a amino-alanínom ako sacharidovými akceptormi. Pripravili sme modely pre všetky tri navrhnuté reakčné mechanizmy, ktoré boli publikované. Ako prvý krok sme urobili sadu QM/MM metadynamických simulácii na určenie aproximatívnej plochy voľnej energie katalytickej reakcie na odhad rekčnej cesty.

Na základe štruktúry aktivovaného komplexu (AK) invertujúcej glykozyltransferázy GnT-I sme navrhli niekoľko základných skeletov napodobňujúcich štruktúru AK. Z verejných databáz dostupných fragmentov, sme pripravili štruktúrne databázy fragmentov, ktoré budú použité na úpravu navrhnutých základných skeletov. Aktuálne databáza obsahuje okolo 40 000 rôznych fragmentov.