VedecDr. Ivana Nemčovičová
Názov projektuModulácia imunitnej odpovede cytomegalovírusom a jej imunoterapeutický potenciál
Hostiteľská organizáciaBiomedicínske centrum SAV
Dĺžka projektu01.07.2015 - 31.12.2018

Abstrakt
Charakterizácia molekulárnych a štruktúrnych základov hostiteľsko-vírusových proteínových interakcií je preto dôležitá pre naše ďalšie pochopenie imunitnej rovnováhy v organizme, ktorá vzniká v priebehu vírusovej infekcie a prečo narušením tejto rovnováhy dochádza ku vzniku tohto ochorenia. Ako je známe, receptory a ligandy z rodiny imunoglobulínov (Ig) alebo molekuly nekrotizujúce rôzne nádory (TNF) zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri obrane hostiteľa, a preto je dôležité objasnenie stratégií, ktoré vírus používa na ovplyvnenie imunitnej odozvy. Ľudský cytomegalovírus je v populácii veľmi rozšírený herpesvírus a v súčasnosti je klinicky najvýznamnejším pôvodcom oportúnnych infekcií u imunodeficientných pacientov. HCMV je svetovou paradigmou efektívneho úniku pred našim imunitným systémom; jeho kľúčová schopnosť navodiť latenciu vo svojom hostiteľovi po prekonaní primárnej infekcie a možnosť reaktivovať sa kedykoľvek následkom oslabeného imunitného systému spolu spôsobujú účinné potlačenie ochrannej funkcie NK a T buniek v organizme. Za týmto účelom plánujeme rekombinantne pripraviť, charakterizovať a stanoviť expresné a purifikačné profily vírusových i ľudských génov, ktoré sú asociované s procesmi cytotoxicity a viroprotektivity v bunke, pričom tieto procesy budú tiež študované. Očakávame, že týmto multidisciplinárnym prístupom budeme schopní navrhnúť a charakterizovať vhodných kandidátov s imunomodulačnými účinkami. V skratke, cieľom projektu je teda objasnenie mechanizmov, ktorými vírus HCMV efektívne uniká pred imunitným systémom na molekulárnej úrovni. Riešením tohto projektu prispievame tiež k vývoju imunomodulačných biologických látok pre liečenie HCMV infekcie. Okrem toho, podrobné skúmanie perzistencie HCMV posúva dopredu možnosť jeho použitia ako jedinečný nosič pre vakcíny pri liečbe rakoviny alebo iných autoimunitných ochorení.

Zhrnutie projektu s priebežnými výsledkami

Ako reprezentat najväčšieho ľudského herpesvírusu, HCMV predstavuje jedinečnú paradigmu pri imunitnej obrane hostiteľa, nakoľko si tento vírus vyvinul niekoľko silných mechanizmov ako sa úspešne vyhnúť detekcii imunitným systémom a prežiť v ľudskom organizme. Imunomodulačné gény, ktoré tu študujeme (viď obrázok), aktívne podporujú perzistenciu tohto vírusu vzhľadom na ich schopnosť zabrániť expresii rôznych génov k bunkovému povrchu. HCMV systematicky potláča povrchovú expresiu bunkových receptorov smrti ako aj aktivátorov NK buniek. Len nedávno sme objavili vírusový gén UL141, ktorý hrá hlavnú úlohu pri obrane vírusu prostredníctvom nových, priamych a nekanonických interakcií s bunkovými receptormi. Zistili sme, že UL141 v izolácii je schopný potláčať bunkovú expressiu CD155 aj TRAIL-R2 súčasne, ale ukázalo sa, že účasť ďalšieho HCMV-kódovaného faktora je nevyhnutná k účinnému potlačeniu CD112 z bunkového povrchu. Naše najnovšie výsledky ukazujú, že UL141 a vírusový US2 tvoria molekulový komplex s cieľom spoločne naviazať CD112 a uskutočniť jeho degradáciu. Tieto vírusové proteíny sú preto potenciálnymi modulátormi viacerých imunitných dráh a mohli by preto pôsobiť ako taký multifunkčný uzol, ktorý inhibuje imunitné rozpoznávanie a pôsobí tak proti zabíjaniu HCMV infikovaných buniek. A preto, molekulárne základy HCMV UL141- a US2-sprostredkovaných interakcií s CD155, CD112 a ďalšími TRAIL bunkovými receptormi smrti (TRAIL-R1, -R3, -R4,) boli úspešne charakterizované v rámci tohto projektu. Celkové glykozylačné profily boli skúmané rôznymi technikami s cieľom určiť ich relatívnu dôležitosť. Ukázali sme, že UL141 má k dispozícii dva N-glykozidy, ktoré sú alternatívne obsadzované cukornatou zložkou v aktívnej molekule. Charakterizovali sme tiež komplexy spomínaných molekúl pomocou rôznych biochemických a biofyzikálnych metód a tie, ktoré preukázali najvyššiu afinitu sme podrobili kryštalizácii. K štruktúrnej analýze boli tiež pripravené homológne modely TRAIL-R1–R4 molekúl, ktoré budú neskôr použité k molekulárnemu nahradeniu pri riešení kryštálovej štruktúry. Väzobné podmienky signálnej funkcie UL141 boli sledované pomocou pripravených mutantov, ktoré diferenciálne viažu rôznych endogénnych partnerov. Tieto mutanty (vrátane nedimerizujúceho mutantu) nám umožnili analyzovať minimálne väzobné požiadavky na UL141, ktoré sú dôležité pri regulácii imunitnej odpovede ako aj inhibícii NK buniek. Kým kanonická signalizácia TNF receptorov dochádza prirodzenou trimerizáciou ich ligandov, naše predbežné údaje ukazujú, že dimérna molekula UL141 je schopná tiež do istej miery indukovať aktiváciu NFκB po pridaní k TRAIL-DRS-exprimujúcim bunkám. Avšak táto signálna funkcia UL141 nebola doteraz potvrdená a ani vyvrátená žiadnym iným testom. Nad rámec plánu sa nám tiež podarilo určiť a charakterizovať molekulárne základy interakcií medzi mediátorom vstupu herpesvírusu (HVEM) a novým obojsmerne pôsobiacim NK bunkovým modulátorom (CD160). Tieto výsledky spolu s predbežnou kryštalografickou analýzou predstavujú prvú správu o samotnej existencii CD160 molekuly študovanej na proteínovej úrovni, ktorá, ako sme ukázali, tvorí disulfidový aktívny trimér a tým sa podieľa na obojsmerných HVEM signálnych dráhach. Okrem toho sme sa tiež zúčastnili štúdií týkajúcich sa objasnenia mechanizmu ľudského enzýmu, ktorý má vysoké imunomodulačné účinky na T lymfocytoch, pričom sa používa ako jediný účinný molekulárny marker degranulácie v žírnych bunkách. V spolupráci sme ako prvý publikovali katalitický mechanizmus ľudského imunomodulačného nukleoplasmatického génu, nazvaného HexD a identifikovali jeho kľúčové väzobné miesta.   Táto sofistikovaná viacsmerná regulácia sledovaných proteínov môže predstavovať univerzálny mechanizmus imunitného rozpoznávania rozmanitých patogénov, ktoré v širšom kontexte môžu byť potenciálnymi cieľmi pre terapeutickú manipuláciu.