VedecPhD Tereza Goliaš
Názov projektuCielený zásah karbonickej anhydrázy IX a pyruvát dehydrogenázy kinázy 1 v hypoxických kolorektálnych nádoroch
Hostiteľská organizáciaBiomedicínske centrum SAV
Dĺžka projektu01.06.2015 - 31.05.2018

Abstrakt
Glykolytický metabolizmus spĺňa požiadavky pre rast buniek v hypoxickom nádorovom mikroprostredí a pomáha im tak prežiť. Navyše schopnosť odpovedať na znížený parciálny tlak kyslíka indukciou karbonickej anhydrázy IX (CAIX) a pyruvát dehydrogenázy kinázy 1 (PDHK1), ktoré majú úlohy v pH regulácii a v metabolizme glukózy, sa zdá, že je nutná pre rast nádorových xenograftov a ich vysoká expresia v ľudských nádoroch súvisí so zlou prognózou pacientov. Tieto dva proteíny regulované hypoxiou preto predstavujú nádejné ciele pre dizajn nových, neštandardných chemoterapeutík, ktoré by negatívne ovplyvnili proliferáciu nádorových buniek a ich prežívanie a zároveň by sa predišlo toxicite na zdravých tkanivách alebo zvýšila účinnosť štandardných terapeutík. Tento projekt skúma molekulárne mechanizmy regulujúce CAIX a PDHK1 v hypoxickom mikroprostredí a snaží sa ich cielene zasiahnuť v kolorektálnych nádoroch a zároveň stratifikovať pacientov, ktorí by z takejto cielenej terapie na nádorové mikroprostredie profitovali a zlepšilo by sa tak ich prežívanie.

Zhrnutie projektu s priebežnými výsledkami

Cieľ 1 projektu má za úlohu objasniť reguláciu aktivity pyruvát dehydrogenázy kinázy 1 (PDHK1) v hypoxii, konkrétne úlohu proteínkinázy A (PKA). Cieľ 2 analyzuje spojenie medzi expresiou PDHK1 a karbonickej anhydrázy IX (CAIX) a nakoniec v cieli 3 sa pokúšame cielene zasiahnuť PDHK1 a CAIX, ako kombinovaná terapia hypoxických nádorov.

Popis uskutočnených experimentov

Experimenty uskutočnené v súvislosti s cieľom 1 zahŕňajú 2D Western blot normoxických a hypoxických bunkových lyzátov, kde sme chceli pozorovať diferenciálny posun v signále, ktorý by naznačoval kovalentnú modifikáciu proteínu PDHK1. Taktiež sme imunoprecipitovali overexprimovanú, značenú PDHK1 z normoxických a hypoxických buniek a odoslali do proteomického laboratória, kde budú vzorky analyzované hmotnostnou spektrometriou.  Ďalej sme testovali účinky inhibítorov a aktivátorov PKA na aktivitu PDHK1.

V prípade cieľov 2 a 3, sme vytvorili bunkové línie s vyradeným génom pre PDHK1 pomocou metódy CRISPR (vrátane dizajnu a naklonovania konštruktov).  Tieto bunkové línie sme použili na preukázanie jedinečnej schopnosti PDHK1 fosforylovať Ser232 na E1a podjednotke pyruvát dehydrogenázy (PDH).  Funkčný dopad absencie tejto inhibičnej fosforylácie sme vyhodnotili na samotnej aktivite PDH, na bunkovom metabolizme (pomocou SeaHorse Exctracellular Flux Analyzer prístroja), na raste nádorových xenograftov a na klonogénnom prežívaní buniek v podmienkach zníženej glukózy a glutamínu.  Ďalej sme pre cieľ 3 testovali účinky inhibítora CAIX, všeobecného inhibítora PDHK a ich kombinácie, na prežívanie kontrolných a PDHK1 knockoutových buniek.

Opis najdôležitejších dosiahnutých výsledkov

Pozorovali sme posun v signále pre hypoxický PDHK1 proteín na 2D-Westerne, čo poukazuje na jeho kovalentnú modifikáciu v podmienkach hypoxie (kde je PDHK1 aktivovaná), medzi ktoré spadá aj fosforylácia.  Po inkubácii buniek s Br-cAMP (aktivátor PKA), sme pozorovali nárast aktivity PDHK1 v normoxii.  Oba tieto výsledky sú veľmi sľubné v súvislosti s možnou reguláciou aktivity PDHK1 v hypoxii prostredníctvom PKA.

Veľmi dôležitým výsledkom je dôkaz, že PDHK1 je jediná kináza schopná fosforylovať Ser232 na E1α PDH in vivo.  Neprítomnosť tejto fosforylácie vedie k aktívnejšej PDH aj v hypoxii, ktorá zase stimuluje oxidatívny metabolizmus za hypoxických podmienok (opak Warburgovho efektu).  Bunky neschopné fosforylovať Ser232 na PDH rastú oproti kontrolám signifikantne pomalšie ako nádorové xenografty.

Treatovanie buniek s inhibítorom CAIX v kombinácii so všeobecným PDHK inhibítorom malo synergický negatívny vplyv na viabilitu buniek.

Očakávané finálne výsledky

Na základe vyššie popísaných výsledkov prvého roku riešenia projektu dúfame, že sa neskôr ukáže, že PKA reguluje aktivitu PDHK1 a že cieleným zasahovaním CAIX spolu s PDHK1 by sme mohli preukázať signifikantný negatívny vplyv na proliferáciu a prežívanie nádorových buniek.