VedecRNDr., PhD. Jana Jakubikova
Názov projektuMM klonálna dynamika
Hostiteľská organizáciaBiomedicínske centrum SAV
Dĺžka projektu01.09.2015 - 31.12.2018

Abstrakt
Riešenie projektu je zamerané na problematiku intraklonálnej heterogenity u mnohopočetného myelómu – krvnej malignity B-lymfocytového radu, ktorá vzniká klonálnou proliferáciou malígnych plazmatických buniek v kostnej dreni. Hlavným cieľom projektu je identifikácia klonálnej heterogenity vo vyšetrovaných vzorkách, intraklonálnej dynamiky v procese progresie ochorenia, ako aj fenotypových zmien jednotlivých komponentov kostnej drene počas prechodu z premalígneho štádia na malígne ochorenie. Dôležitou súčasťou projektu je zhodnotenie vplyvu chemoterapie a imunoterapie na dynamiku klonálnej kompozície a štúdium úlohy nádorového mikroprostredia na klonálnu selekciu. Získané poznatky majú využitie pre vývoj nových personalizovaných diagnostických kritérií a terapeutických prístupov nasmerovaných proti koexistujúcim nádorovým subklonom.

Zhrnutie projektu s priebežnými výsledkami

Na charakterizáciu dynamiky nádorovej intra/interklonálnej heterogenity počas vývoja a progresie mnohopočetného myelómu (MM) z hľadiska bunkovej a molekulárnej komplexnosti som v rámci riešenia špec. cieľa 1 využila “time of flight” hmotnostnú cytometriu (CyTOF), pomocou ktorej som analyzovala vzorky kostnej drene pacientov s MM v limitovanom objeme na úrovni jednej bunky. CyTOF je nová vysoko-dimenzionálna technológia, ktorá umožňuje simultánne vyhodnotenie až 40 parametrov na bunkovom povrchu (imunofenotyp), ako aj vo vnútri buniek (signálne/regulačné molekuly a transkripčné faktory).

            Navrhla som 3 rôzne panely protilátok, pričom každý panel umožňuje analýzu 40 bunkových markerov (spolu približne 100 markerov, keďže niektoré sú spoločné pre viaceré panely). Špecifické protilátky v týchto paneloch som značila pomocou vzácnych elementárnych ťažkých kovov (lantanoidov). Všeobecne platí, že negatívny príspevok nečistôt a oxidácie kovov používaných pri CyTOF technológii je pomerne nízky v porovnaní s prekryvom fluorescenčných spektier fluorochrómov pri prietokovej cytometrii. Avšak, navrhovanie funkčných panelov protilátok predstavuje dôležitý krok, v ktorom je potrebné determinovať kanály, ktoré možnu prispievať pozadím a tiež tie, ktoré môžu prijímať signál z pozadia. Na základe týchto poznatkov som jednotlivé špecifické protilátky konjugovala s príslušnými vzácnymi kovmi (lantanoidmi). Po naviazaní kovov na protilátky som validovala ich účinnosť pri použití negatívnych a pozitívnych kontrol (bunkové línie s pozitívnou expresiou príslušného markera vs. línie s negatívnou expresiou alebo stimuláciou expresie príslušného markera pomocou látok/cytokínov) pomocou CyTOF a tiež porovnaním s analýzou pomocou fluorescenčnej prietokovej cytometrie.  

Na zhodnotenie B-bunkovej hematopoézy v MM som navrhla dva panely, v ktorých som použila protilátky proti markerom, ktoré definujú jednotlivé vývojové štádia B lymfocytov od hematopoetickej kmeňovej bunky až po zrelé B bunky, ako aj markery na identifikáciu klonálnych plazmatických buniek (CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD38, CD45, IgA, IgD, IgG a IgM). Na detekciu malígnych plazmatických buniek som konzistentne používala analýzu expresie 6 markerov: CD19/CD38/CD138/CD45/cyt-kappa/cyt-lambda vo všetkých paneloch. Výsledné vysoko-dimenzionálne dáta sú zobrazené pomocou SPADE (spanning-tree progression analysis of density-normalized events) a/alebo viSNE analýzy (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) algorithm). Pomocou klastrovacej SPADE analýzy použitím softwéru Cytobank som identifikovala hlavné maturačné štádia B lymfocytov: pro-B, pre-B I, pre-B II, nezrelé B bunky, naivné (zrelé) a prechodné B bunky, pamäťové B bunky, plazmablasty and plazmatické bunky (obrázok 1)). Na štúdium nádorovej heterogenity som na komplexnú analýzu B-bunkovej línie  v mojich paneloch použila regulačné molekuly s dôležitou funkciou v B-signálnych dráhach, ako sú špecifické povrchové markery (CD25, CD28, CD47, CD52, CD56, CD81, CD117, CD184, CD200, CD221, CD243, CD319, CD338) a intracelulárne markery (sXBP1, IRF4, MYD88, FGFR3, Notch1, Sox-2, c-Myc, Bcl-6, Blimp-1, Pax5, RARa2). 

Predbežné výsledky z klastrovacej SPADE analýzy expresie CD38 u novo-diagnostikovaného MM pacienta s t(11;14) translokáciou (SPADE obr.1) ukazujú vysokú expresiu CD38 v B-bunkových prekurzoroch od štádia pro-B po zrelé B bunky (oranžová farba) s najvyššou intenzitou u malígnych plazmatických buniek (červená). Minimálna expresia CD38 bola zistená v oboch podskupinách pamäťových buniek (zelená až modrá). V klastroch plazmatických buniek a plasmablastov som zistila odlišnú expresiu povrchových markerov (CD319 and CD56) a intracelulárnych regulačných molekúl (sXBP-1, cyto-kappa, IRF-4, FGFR3, Nanog; obr.1 v rámčeku pod SPADE stromom), čo dokumentuje výhody využitia CyTOF technológie na štúdium nádorovej heterogenity.

            Keďže MM je charakterizovaný dysfunkciou imunitného systému, v rámci špec. cieľa 3 som analyzovala vplyv imunitného systému na klonálnu dynamiku v nádorovom mikroprostredí počas vývoja a progresie MM. Pre tento účel som navrhla panel 40 markerov pomocou  ktorého som mohla definovať populácie imunitných buniek: NK bunky a ich subpopulácie, NKT bunky, T bunkové populácie (pamäťové CD4T, naivné CD4T, pamäťové CD8T, naivné CD8T, T regulačné bunky a Tg/d bunky), monocyty, myeloidné a plazmacytoidné dendritové bunky (DC), bunky granulocytárnej a erytroidnej línie, trombocyty a nádorové bunky.

Vysoko-dimenzionálne dáta zo SPADE analýzy imunitných subpopulácií novo-diagnostikovaného MM pacienta sú uvedené na obr.2. Najvyššia intenzita expresie CD45 bola pozorovaná u T a B lymfocytov, NK buniek a monocytov (červená), stredná intenzita u granulocytov (oranžová až žltá). Signifikantne nižšia expresia CD45 bola pozorovaná u plazmatických buniek a erytroidnej línie (zelená až modrá). Identifikovala som dve hlavné populácie T lymfocytov: pomocné CD3+/CD4+ a cytotoxické CD3+/CD8+ lymfocyty, aj na základe expresie CD2, CD5 a CD7 markerov. NKT bunky boli identifikované na základe CD3+/CD161+ expresie v rámci T bunkovej populácie, zatiaľčo NK bunky klastrovali oddelene a boli identifikované na základe CD3-/CD56+/CD16+/CD161+/CD7+ a CD2 expresie (obr.2B).

Na obr. 2C uvádzam postup (manual gating), ktorým som identifikovala bunky pomocou DNA interkalačnej farbičky Ir191/193 (i) odstránila dublety (ii) a identifikovala mŕtve bunky (iii). V populácii CD45+/- živých buniek (iv) som identifikovala CD3+ bunky (v) a následne dve populácie lymfocytov: pomocné CD4+T a cytotoxické CD8+ T bunky. Taktiež som identifikovala naivné a pamäťové bunky, ako aj regulačné Treg lymfocyty. Podobne som v rámci CD3+ (v) populácie identifikovala CD161+ NKT bunky. NK bunky (obr. 2C) som identifikovala na základe expresie CD56 a CD16 v rámci CD3-/CD19- (vi) populácie vymedzenej z pôvodnej populácie všetkých živých buniek CD45+/- (iv). Na identifikáciou monocytov, DC a granulocytov som použila kombináciu niekoľkých markerov (obr. 2D). Podobným postupom som v rámci CD3-/CD19- (vi) populácie identifikovala: monocytárnu diferenciačnú líniu CD13+/HLA-DR+/CD33+ smerom k zrelým monocytom exprimujúcim CD14+ a granulocytárnu líniu HLA-DR-/CD33-/CD11b+ smerom k zrelým CD16+ neutrofilom. Manuálnym ohraničením CD3-/CD19-/CD14-/CD16- populácie s pozitívnou expresiou HLA-DR+ som detekovala plazmacytoidné DC (CD123+CD11c-) a myeloidné DC (CD123-CD11c+) oproti HLA-DR-/CD123+ populácii, ktorá predstavuje bazofily (obr. 2E). B bunky boli identifikované SPADE analýzou na základe fenotypu CD45+/CD19+/CD38+/CD138- a expresie cyto kappa+ alebo cyto lambda+, malígne plazmatické bunky podľa fenotypu CD45-/CD19-/CD38++/CD138+/cyto kappa+ versus lambda- (obr. 2F). CD38+ bunky s CD138+ expresiou reprezentujú cyto kappa+ klon malígnych plazmatických buniek, zatiaľčo CD38+ bunky pozitívne na expresiu CD19 a oboma cyto kappa a cyto lambda pozitivitou predstavujú B bunky (obr. 2G). Taktiež som detekovala bunky erytroidnej línie a trombocyty (obr. 2H).

Moje predbežné vysoko-rozmerné dáta z analýzy vzoriek MM pacienta pred a po terapii pomocou viSNE algoritmu ukazujú signifikantné zníženie malígnych plazmatických buniek, avšak minoritný malígny klon stále perzistuje: novo-diagnostikovaný MM pacient pred (horný riadok) a po Revlimid-Velcade-Dexamethasone terapii (spodný riadok). Taktiež som pozorovala pokles imunitných buniek (B bunky, T bunky, monocyty a granulocyty, obr. 3). SPADE a viSNE analýzy mi umožnia korelovať klonálne zastúpenie malígnych plazmatických buniek s celkovým stavom imunitného sytému nielen u jednotlivých pacientov, ale aj s ohľadom na špecifickú terapiu.